本生一秒鐘帶您了解pcr耗材，八聯(lián)管、pcr96孔板的選擇!

　　我們來聊聊PCR實(shí)驗(yàn)中很關(guān)鍵的要素——耗材。作為PCR?？停私釶CR耗材相關(guān)的特性和術(shù)語是有必要的。

　　市面上的PCR耗材有很多，各種品牌、規(guī)格、顏色等，讓人眼花繚亂。我們來慢慢認(rèn)識(shí)它。材質(zhì)PCR耗材的原材料通常是聚丙烯。它是一種很好的耐熱惰性物質(zhì)(使用溫度范圍為-30～140℃)，能夠承受PCR反應(yīng)熱循環(huán)過程中的熱能變化，很好地封閉和保護(hù)PCR反應(yīng)體系中的物質(zhì)。

　　顏色常見的有白管和透明管。在傳統(tǒng)PCR實(shí)驗(yàn)中，兩者沒有區(qū)別。但是，在相同的熒光定量/qPCR實(shí)驗(yàn)中，對于頂端信號(hào)讀取的qPCR儀器(在管的上方采集熒光信號(hào))來說，白管的靈敏度和一致性相對更高(下圖A和B)。這是為什么呢?

　　與透明管相比，A 白管得到的Ct值更低;B 白管得到的重復(fù)性更好

　　qPCR的核心數(shù)據(jù)是Ct值，而熒光信號(hào)是Ct值計(jì)算的數(shù)據(jù)來源，所以管內(nèi)的熒光能否完好地傳遞至檢測器是至關(guān)重要的。白色的管壁能夠阻止熒光穿過管壁和折射(下圖A)，進(jìn)而防止熒光傳至加熱模塊(放管子的金屬孔壁)，被模塊吸收或發(fā)生不一致反射等情況。相比于透明管，在白管的頂端能夠采集到更強(qiáng)，更聚焦的熒光信號(hào)(下圖B)。

　　A 透明管和白管中熒光信號(hào)走向;B 分別加入等量熒光素后，熒光強(qiáng)度對比

　　So，假如你正在使用的是頂讀qPCR儀，那么安利一下，不妨用白管試試哦~

　　質(zhì)量(是否干凈)這里強(qiáng)調(diào)一下耗材質(zhì)量的重要性。qPCR耗材必須保證沒有污染物和抑制劑。高壓和輻射能夠去除細(xì)菌和DNA酶，但不能去除灰塵和DNA殘留，它們可能會(huì)抑制PCR反應(yīng)或產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。物質(zhì)是具有吸光度的，即便是很小的污染物也會(huì)吸收反應(yīng)體系中的熒光，影響熒光信號(hào)的采集。用一個(gè)夸張版的實(shí)驗(yàn)來演示一下雜質(zhì)污染對實(shí)驗(yàn)的影響，如下圖所示，在八聯(lián)排的一個(gè)反應(yīng)孔中放入一粒雜質(zhì)，不出所料，擴(kuò)增結(jié)果曲線出現(xiàn)了顯著的異常。

　　↑ 8復(fù)孔重復(fù)性反應(yīng)結(jié)果，左邊孔中的雜質(zhì)讓曲線“跑偏"

　　Tips 注意不要讓耗材長期暴露在空氣中，取出耗材后，一定要快速封好包裝袋，避免用裸手接觸。有條件的話，可在超凈臺(tái)中操作。容量/尺寸/通量

　　容量決定了可加樣的多少(反應(yīng)體積)。加樣過多會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)效率下降，溢出或交叉污染;而加樣不足會(huì)引起樣品蒸發(fā)損耗。qPCR儀的加熱模塊也會(huì)決定可適配的耗材和適用的反應(yīng)體系大小。通量很容易理解，就是單次實(shí)驗(yàn)?zāi)苌隙嗌賯€(gè)樣品。常見的容量和通量規(guī)格如下表所示：

　　單管/八聯(lián)排0.2mL、0.1mL

　　96孔板0.2mL、0.1mL

　　384孔板0.02mL

　　容量規(guī)格也常用標(biāo)準(zhǔn)和低容量來區(qū)分，如下圖所示。low profile(低容)耗材的高度更低，這種短小的設(shè)計(jì)減少了反應(yīng)體系上方的空間(“死體積"——無用部分)，降低熱循環(huán)過程中的蒸發(fā)影響，同時(shí)能夠讓加熱模塊更大程度地將其包裹，提高熱傳導(dǎo)效率。因此，低容管也被稱為“快速"管或板。

　　Tips 常見的反應(yīng)體積一般為20 µL，推薦使用0.1 mL或low profile的低容反應(yīng)管。管壁厚度

　　PCR耗材的管壁厚度要均一，才能提供一致的熱傳導(dǎo)。超薄管壁較標(biāo)準(zhǔn)版薄50%，可進(jìn)一步減少熱屏障，帶來更快更好的反應(yīng)效果。當(dāng)然，建議選超薄的。

　　透明度qPCR的管蓋和封膜需要具有很高的光學(xué)透性，確保的熒光信號(hào)的穿透和傳遞，減少失真(針對頂讀qPCR儀)。管壁的透明度越高反倒會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，理由在前面解釋過。傳統(tǒng)PCR可忽略此特點(diǎn)。裙邊PCR板的裙邊指的是板的周圍延伸部分。額.......這個(gè)裙邊作用是在構(gòu)建反應(yīng)體系時(shí)為移液過程提供穩(wěn)定性支撐，以及結(jié)合自動(dòng)化工作站時(shí)提供機(jī)械強(qiáng)度和抓手。常見的有三種：無裙邊、半裙邊和全裙邊(對應(yīng)下圖A、B、C)。

　　Tips 簡單理解就是，裙邊的意義更多在于為工業(yè)化、自動(dòng)化批量處理提供便利，與機(jī)械臂的結(jié)合。在常規(guī)科研實(shí)驗(yàn)室中可能不太需要，使用無裙邊板即可。

　　封板膜

　　PCR封板膜由透明塑料或鋁箔制成。黏性透明薄膜比較常見，適配于96或384孔板，要有足夠好的光透性?？梢栽诜饽r(shí)用個(gè)小卡片把孔周圍的膜壓緊，避免漏氣等現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室里的貼膜boy們應(yīng)該很熟悉了吧?？梢院唵卫斫鉃?.....

　　黏性鋁膜可能比較少見，盡管不適合qPCR，但對于光敏樣品還是合適的耗材，由于可以穿刺，便于PCR中樣品轉(zhuǎn)移。(適用于傳統(tǒng)PCR)

　　總結(jié)：

　　耗材作為PCR體系的載體，對提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量是非常重要的。希望本分享能夠讓你了解PCR耗材的一些小知識(shí)。

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